在园里搜的!
材料和方法
1．1 试剂和仪器 SDS、脲、甘油、过硫酸铵均为分析纯，西安化学试剂厂出品；丙烯酰胺（分析纯）为汕头市光华化学厂产品；N，N′-甲叉双丙烯酰胺（分析纯）为浙江黄岩人民化工厂生产； Tris（分析纯）为成都试剂厂出品；TEMED为BIO-RAD产品；Tricine(Ultra Pure Grade)为Solon Ind产品. BIO-RAD小型垂直式电泳附件模具；FD-201稳压稳流电泳仪（上海医用分析仪器厂）.
1．2 肽分子质量标准 肽分子质量标准的Mr范围2512～16949为Pharmacia LKB 公司产品. 胸腺肽α1是美国加州圣马刁市赛生药品公司产品（商品名“ZADAXIN”），是一乙酰化的多肽，Mr为3108， pI 3.8. 经 Sephadex G-25柱去除所含的甘露醇， 然后冷冻干燥，用样品缓冲液配成所需样品.
1．3 方法
1．3．1 电泳贮存液的配制 阳极缓冲液中Tris为0.2 mol.L-1用HCl调pH值至8.9. 阴极缓冲液为0.1 mol.L-1 的Tris， 0.1 mol.L-1的Tricine和0.01 g.L-1的SDS溶液，其pH值约为8.25. 胶缓冲液为3.0 mol.L-1的Tris和 0.03 g.L-1的SDS，用HCl调pH值至8.4.
称取48 g丙烯酰胺和1.5 g N，N′-甲叉双丙烯酰胺溶于100 mL纯水中，溶解混匀后经4号滤纸过滤即得到495 g.L-1 T，30 g.kg-1 C的贮存液；称取46.5 g丙烯酰胺和3.0 g N，N′-甲叉双丙烯酰胺溶于100 mL纯水中，同样得到495 g.L-1 T，60 g.kg-1 C的贮存液（T代表丙烯酰胺的总浓度，C代表交联度）.
1．3.2 胶的制备 与一般SDS-PAGE电泳相似［3］，按Tab 1给出的数据分别配制分离胶、间隙胶和浓缩胶，依次灌胶.
表 1 分离胶、间隙胶和浓缩胶的组成
Tab 1 Composition of separating, spacer and stacking gels
Composition Acrylamide solution AV/mL Acrylamide solution BV/mL Gel buffer(V/mL) Urea Distilledwater(V/mL) Persulfate of100 g.kg-1(V/μL) TEMED(V/μL) Finalvolume(V/mL)
Separating gel160 g.L-1 T, 60 g.kg-1 Cwith 6 mol.L-1 urea - 3.3 3.3 3.6 1.0 45 4.5 10.05
Spacer gel100 g.L-1 T, 30 g.kg-1 C 0.60 - 1.0 - 1.40 20 2.0 3.02
Stacking gel 60 g.L-1 T, 30 g.kg-1 C 0.30 - 0.93 - 1.27 25 2.5 2.53
A:495 g.L-1T,30 g.kg-1C;B:495 g.L-1 T,60 g.kg-1C. T: the total percentage concentration of both monomers； C: the percentage concentration of the corosslinkage.
1．3.3 样品缓冲液的制备及样品的处理 蛋白质样品与上样缓冲液（4 g.L-1 SDS，120 g.L-1甘油，50 mol.L-1 Tris，20 mL.L-1巯基乙醇含0.1 g.L-1溴酚蓝，pH 6.8）混合均匀，分别按40 ℃孵育30 min；60 ℃孵育10 min和煮沸2 min处理.
1．3．4 电泳条件 内槽装阴极缓冲液、外槽用阳极缓冲液恒压电泳，先40 V约1 h，当样品进入分离胶时，电压升至60 V约2 h.
1．3．5 染色、脱色和胶的保存 电泳完毕时胶置于染色液［ 2.5 g.L-1考马斯亮蓝R-250的乙醇（V）∶冰乙酸（V）∶水（V）为9∶2∶9 ］中振荡染色1.5～2 h，转至脱色液（400 mL.L-1的乙醇，40 mL.L-1的冰乙酸）中扩散脱色，直到背景清晰. 胶的保存与一般SDS-PAGE类同［3］.
2 结果
2．1 不同处理的样品对SDS-PAGE的影响 多肽样品经上述3种不同处理，经SDS-PAGE后，分子质量蛋白标准（Mr 2512～16949）没有电泳差异，均能较清晰地显示6条带（Fig 1）. 分子质量蛋白标准分别在每孔上不同量的蛋白质（Fig 2），当上样量为1 μg时，分子质量蛋白标准仅能显示其中的5条带. 当上样量达到5～10 μg时，Mr 2512的肽带明显可见.
2．2 分子量标准蛋白回归方程及对低分子量标准品的分析 应用160 g.L-1T，60 g.kg-1C含6 mol.L-1脲的丙烯酰胺凝胶能够较好地显示标准蛋白的6条带（Fig 1）. 对其Mr对数（lgMr）和在分离胶中迁移的距离（μ）进行直线回归分析，回归方程为 = -0.0378x + 4.5512，相关系数r = -0.962，从曲线查及胸腺肽α1单体的Mr为3135（其理论Mr为3108）.
图 1 样品的不同处理
Fig 1 Treated samples with different condition
Lane 1, 4: 40℃ 30 min; Lane 2, 5: 60℃ 10 min; Lane3,6:100℃ 2 min
图 2 样品量的不同对电泳的影响
Fig 2 Quantity's effect on electrophrosis
From lane 1 to 6 the protein quantity is 4, 8, 12, 16, 20, 24 μg respectively.
3 讨论
SDS-PAGE的有效分离范围取决于聚丙烯酰胺的浓度和交联度，其孔径随着双丙烯酰胺：丙烯酰胺比率的增加而减小，比率接近于1∶20时，孔径达到最小值［3］. Mr低于10 000的小分子肽，即使用较高浓度的聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE也不能完全分离［2］. 杨联萍等［4］指出用含脲的SDS-PAGE，即使用银染方法Mr小于8000的蛋白标准品也无着色. 而我们用含6 mol.L-1脲160 g.L-1 T，60 g.kg-1 C的SDS-PAGE方法，不需银染而直接用2.5 g.L-1的考马斯亮蓝R-250染色1.5～2 h，即可把标准品中的6条带显示得非常清楚，且简单方便，上样量小，重复性好. 实验范围内（蛋白标准Mr为2512～16 949）肽Mr的对数与迁移率呈良好的线性关系，相关系数r = -0.962. 我们以低Mr胸腺素α1作参照，其结果3153与实际Mr 3108标准相符，从而证明该方法的准确性和待测样品结果的可信性，该方法是一种显示小分子多肽和估测其Mr的较好方法. 在含SDS缓冲液的样品中，小分子多肽的浓缩是较困难的，这是因为小分子多肽与SDS形成的复合体具有和SDS本身类似的电荷和大小，因此浓缩对于小分子多肽的SDS-PAGE来说就成了一个突出的问题［5］. 上述方法中Tricine 以阳离子形式存在可以作为拖尾离子，使小分子多肽能够在浓缩胶中形成尽可能窄的带. 此外，快速的固定、染色和脱色对于小分子多肽电泳是必要的. 这主要是由于小分子多肽对染料的结合力较弱，易扩散冲洗掉而着色较差.随着生物活性多肽物质的发现和多肽类药物的研制，小分子多肽电泳变得越来越重要，已成为生物活性物质纯化分析过程中不可缺少、经常使用的快速鉴定方法.
作者简介：石继红（1963-），男（汉族），河北省枣强县人. 讲师. Tel.(029)3374774
参考文献：
［1］ Cleveland DW, Fischer SG, Kirschner MW et al. Peptide mapping by limited proteolysis in sodiun dodecyl sulfate and analysis by gel electrophoresis［J］. J Bio Chem, 1977;252(3):1102-1106.
［2］ Sch gger H, Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 KDa［J］. Anal Biochem, 1987; 166(2): 368-397.
［3］ 金冬雁，黎孟枫译. 分子克隆实验指南［M］，第2版. 北京：科学出版社，1992：880-887.
［4］ 杨联萍，孔祥平，易学瑞. SDS-PAGE电泳对小分子多肽的分析［J］. 生物工程进展，1998；18（6）：49-51.
［5］ Fish WW, Reynolds JA, Tanford C. Gel chromatography of proteins indenaturing solvents［J］. J Bio Chem, 1977; 245(19): 5166-5168.
(责任编辑：admin) |